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本制品是表达、纯化获得的一种在mRNA Cap-0帽结构基础上产生Cap-1帽结构的mRNA加帽酶。mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶可以利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构(m⁷GpppNp)的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构(m⁷GpppN^mp)的mRNA。Cap-1帽结构不仅可以增强mRNA的稳定性和翻译效率，进而提高mRNA在显微注射和转染后的表达水平，还可以帮助mRNA逃避体内某些细胞的先天免疫反应。

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase只能作用于带有N7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppNp)，即带有Cap-0帽结构的mRNA，不会作用于5'末端为pN、ppN、pppN或GpppN的mRNA。通常可使用Faustovirus加帽酶制备带Cap-0帽结构的mRNA，然后使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶添加Cap-1帽结构；也可以与Faustovirus加帽酶协同作用，一步添加Cap-1帽结构至mRNA。

图1．mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶对mRNA添加Cap-1帽结构的原理图。mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase以SAM作为甲基供体，催化mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构的mRNA。

• 体内或体外翻译前mRNA的加帽；
  
• Cap-1帽结构中的2'-O甲基化有助于mRNA逃避体内某些细胞的先天免疫反应；
  
• 提高mRNA的翻译效率；
  
• 提高mRNA在显微注射和转染后的表达水平。

由大肠杆菌表达牛痘病毒的mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶基因，经纯化而获得。


在37℃条件下，1小时内使10pmol、长度为80nt的带帽RNA转录本发生甲基化所需的酶量。

组分	2kU	10kU
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase(50U/μL)	40μL	200μL
10×Capping Buffer	200μL	1mL
32mM SAM	10μL	50μL

保存：-20℃，有效期1年。


20mM Tris-HCl (pH8.0@25℃)，100mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.1% Triton X-100，50% Glycerol。


10×Capping Buffer：
500mM Tris-HCl (pH8.0@25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.2% Poloxamer 188。


70℃加热10分钟可使mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶失活。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

• 本制品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• 由于涉及RNA操作，须严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染。
  
• 实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase-free的或须经DEPC处理。不含RNase的超纯水推荐使用无菌无酶超纯水或无酶DEPC水。
  
• 桌面等环境以及仪器设备表面的RNase、DNase、RNA和DNA的去除推荐使用核酸酶/RNA/DNA喷雾清除剂进行快速处理。
  
• 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNaseyi、超纯水等。
  
• SAM在pH值为7～8，37℃条件下不稳定，建议在反应开始前根据实际反应数配制新鲜的工作液并放置于冰上，防止SAM降解。

• mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶对mRNA添加Cap-1帽结构：
  
  • DNA模板的制备：带有T7 Promoter或其它适当启动子的线性化质粒DNA、PCR产物或合成的DNA片段等均可以作为体外转录的模板。
    
  • mRNA的制备：使用T7 RNA聚合酶(YT409/YTB4179/YTB4180)和100mM ATP、100mM CTP、100mM GTP及100mM UTP，或T7体外转录试剂盒，或T7快速体外转录试剂盒或其它启动子对应的酶或试剂盒转录获得mRNA。
    
  • 带Cap-0帽结构mRNA的制备：使用Faustovirus加帽酶制备带N7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppNp，即Cap-0帽结构)的mRNA。
    
  • 4mM SAM的配制：在反应开始前根据实际反应数配制新鲜SAM工作液，将32mM SAM分装并用无菌无酶超纯水稀释至4mM，放置于冰上备用。
    
  • 对带Cap-0帽结构mRNA添加Cap-1帽结构的反应体系的设置。请参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
    

    成分	用量	终浓度
    超纯水	(15.5-x)μL	-
    mRNA(含Cap-0)	x μL	达500ng/μL
    65℃温育5分钟，然后立即置于冰浴中孵育。
    RNase抑制剂(40U/μL)	0.5μL	1U/μL
    10×Capping Buffer	2μL	1×
    4mM SAM	1μL	0.2mM
    mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase(50U/μL)	1μL	2.5U/μL
    总体积	20μL	-

    
    
    • 如果只进行一个反应，请把除mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase以外的组分充分混匀后，再加入mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase；如果同时进行多个反应，可以把上表中除mRNA之外的所有溶液和酶提前预混合后分装到各反应管内，再加入65℃变性5分钟后立即置于冰浴中的mRNA，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀，或用Vortex在最低速度轻轻混匀)后低速离心沉淀液体。
    • 本反应体系中涉及RNA，可以酌情适量添加RNase抑制剂。
    • 体外转录和帽类似物制备的mRNA，使用前应进行纯化，并将mRNA重悬于超纯水中。溶液中不应存在EDTA和盐。mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase可与Faustovirus加帽酶协同作用，一步添加Cap-1帽结构至mRNA。
    • 在与mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase温育前，将mRNA溶液在65℃加热5分钟以打开转录产物5'末端的二级结构。对于5'末端高度结构化的转录产物，可将时间延长至10分钟或适当提高变性温度。
    • SAM在pH值为7～8，37℃条件下不稳定，建议在反应开始前再配制新鲜的工作液并将其放置于冰上，防止SAM降解。
  • 反应条件：37℃孵育60分钟。对于长度小于200nt的RNA，宜将孵育时间延长至2小时或减少底物的用量。
    
  • 终止反应：70℃加热10分钟可使mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase失活。
    
  • 反应后可通过质谱分析或者细胞转染进一步检测加帽效率。
• 其它应用请参考相关文献资料进行。

图2．百奥莱博mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和N公司的同类竞品在EGFP mRNA的Cap-0帽结构基础上产生带有Cap-1帽结构，然后将该mRNA转染293T细胞表达EGFP蛋白的效果图。在25μL反应体系[50mM Tris-HCl(pH8.0@25℃),5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM DTT,0.02% Poloxamer 188,5μg EGFP mRNA,0.8U/μL RNase Inhibitor,0.5mM GTP,0.2mM SAM]中分别加入25U Faustovirus加帽酶，之后加入或不加入100U的本制品或N公司的mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase，37℃孵育60分钟反应生成Cap-1帽结构，70℃孵育10分钟以终止反应。25万个293T (人胚肾细胞)在细胞培养板中培养24小时，每孔使用LP8000转染试剂转染500ng未添加或添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA，继续培养24小时后使用荧光显微镜进行拍照。如图所示，本制品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果，与Faustovirus Capping Enzyme相比，提高了EGFP的翻译效率。a和b分别为未加帽EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；c和d分别为使用百奥莱博mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；e和f分别为使用N公司的mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；g和h分别为使用百奥莱博的Faustovirus加帽酶添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；i和j分别为使用N公司的Faustovirus Capping Enzyme添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片。EGFP mRNA的制备方法：首先以带有T7 Promoter的EGFP完整编码序列的线性化质粒DNA为模板，体外转录获得EGFP mRNA。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
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